概述:
熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴增過(guò)程中,隨著(zhù)PCR循環(huán)數的遞增,PCR產(chǎn)物不斷積累,熒光信號也會(huì )相應的增加,這樣就可以通過(guò)熒光強度的變化來(lái)對PCR反應進(jìn)行實(shí)時(shí)的監測。產(chǎn)品僅供科研使用本公司根據您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針?lè )?。通過(guò)對DNA或RNA的熒光定量PCR監測, 實(shí)現基因的相對定量、定量和定性分析。
產(chǎn)品名稱(chēng) | 英文名稱(chēng) | 貨號 |
羽扇豆源性成分探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 | BKP7446 |
實(shí)時(shí)熒光定量PCR:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統定量只能終點(diǎn)檢測的局限,實(shí)現了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過(guò)對每個(gè)樣品Ct值的計算,根據標準曲線(xiàn)獲得定量結果。因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內標是建立在兩個(gè)基礎之上的:
1)Ct值的重現性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數時(shí),剛剛進(jìn)入真正的指數擴增期(對數期),此時(shí)微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現性極好,即同一模板不同時(shí)間擴增或同一時(shí)間不同管內擴增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線(xiàn)性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數存在線(xiàn)性關(guān)系,可利用標準曲線(xiàn)對未知樣品進(jìn)行定量測定,因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標準曲線(xiàn)定量的方法。
外標準曲線(xiàn)的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴(lài)的科學(xué)方法。利用外標準曲線(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現性*的定量方法,已得到全世界的公認,廣泛用于基因表達研究、轉基因研究,藥物考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖:
使用方法:
一、羽扇豆源性成分探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒稀釋PCR陽(yáng)性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例)
1. 注意:由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進(jìn)行,千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩定性和避免擴散病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對照,只提供可以直接使用的DNA片段作為陽(yáng)性對照。
2. 標記6個(gè)離心管,分別為7,6,5,4,3,2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對照,充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭,在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對照到5號管中,充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個(gè)樣品,必須設置N+2個(gè)提取,多出的一個(gè)是PC(樣品制備陽(yáng)性對照),一個(gè)是NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?/span>10μL上步制備的PCR陽(yáng)性對照的第4號(濃度為1×10E4 拷貝/μL,10μL相當于1萬(wàn)拷貝)或第5號(濃度為1×10E5 拷貝/μL,10μL相當于10萬(wàn)拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設置qPCR反應(20 μL體系,在樣品制備室進(jìn)行)
10. 如果只做1次重復,則標記N+9個(gè)PCR管,其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,1個(gè)用于PCR陰性對照,6個(gè)用于PCR陽(yáng)性對照。如果做2-3次重復,則反應設置數量相應增加2或3倍。
11. 產(chǎn)品僅用于科研在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽(yáng)性對照,并且陽(yáng)性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加)
熒光定量PCR服務(wù):
產(chǎn)品僅供科研使用簡(jiǎn)介:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,該技術(shù)不僅實(shí)現了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化;比較不同組織的mRNA表達差異;驗證基因芯片,siRNA干擾的實(shí)驗結果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),全部實(shí)驗皆使用進(jìn)口試劑完成,主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求:
(01)請您提供新鮮的且盡量多的材料;或直接提供純化好的總RNA(大于 5 ug/樣品);或直接提供純化好的DNA(大于 5 ug/樣品)。
(02)請提供已知的全長(cháng)基因序列。
(03)請提供盡可能詳細的背景資料:DNA/RNA 來(lái)源等
2、熒光定量PCR操作程序
(01)引物(探針)設計與合成。
(02)提取DNA/RNA,樣本逆轉錄成cDNA。
(03)進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗,進(jìn)行實(shí)驗結果分析。
(04)實(shí)驗完成后,提供完整的實(shí)驗報告(含軟件分析結果)及引物等實(shí)驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準:
我公司根據客戶(hù)的樣品數量進(jìn)行不同的收費標準。
PGK1 Others Mouse 小鼠 PGK1 / PGKA 桿狀病毒-昆蟲(chóng)細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) 三嶙酸脫氧胞苷鈉鹽,英文名或英文縮寫(xiě):dCTP,2Na,級別:BR,98%,規格:1 O.D.
人腎上腺皮質(zhì)腺癌細胞;NCI-H295R皂土;膨潤土;漿土;膠狀黏土 Bqntonitq;Wilkinitq;Dqnvqr clcy;qr clcy 130-78-9
HO-8910PM細胞,高轉移細胞 人胃粘膜細胞,GES-1細胞 狗肺成纖維樣細胞;DogL1D-半乳糖鹽酸鹽,英文名或英文縮寫(xiě):D-Galactosamine HC1,級別:高,98%,規格:5KU
tTA基因修飾的小鼠(B類(lèi));P19-CAG-tTA-1F3N-亞硝基本基羥鹽,英文名或英文縮寫(xiě):Cupferron,級別:CP,規格:25克
HA Others H5N1 甲型 H5N1 (A/Indonesia/5/2005) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) N,N-Dimetxylfonmemi7e 500ml原裝 Amresco 0464
NRK-52E(大鼠腎小管導管上皮細胞) 5×106cells/瓶×2 人 APCDD1 人細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) 4'-羥基尼美舒利質(zhì)量規格:美國進(jìn)口4'-Hydroxy Nimesulide
小鼠少突膠質(zhì)前體細胞MOPC咪康唑質(zhì)量規格:美國進(jìn)口Miconazole
LGMN Others Sus scrofa (Pig) 野豬 (Pig) Legumain / LGMN / AEP 人細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) 麥迪霉素質(zhì)量規格:美國進(jìn)口Midecamycin
人胚胎眼Tenon's囊成纖維細胞;HFTF米諾地爾葡萄糖苷酸質(zhì)量規格:美國進(jìn)口Minoxidil Glucuronide
大鼠胸大動(dòng)脈平滑肌細胞;A7r5 細胞,SMMC-7721細胞 ECA細胞,小鼠艾氏腹水瘤細胞加蘭他敏(標準品)質(zhì)量規格:HPLC≥98%,標準品無(wú)
人腎透明細胞癌;Caki-1Haptoglobinfrompooledhumanplasma結合珠蛋白100克高,50u/mg
EFNB1 Others Human 人 EphrinB1 / EFNB1 人細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) 安替比林;;;二基本基吡坐同 cntipyrinq;Phqnyl diMqthylpyrczolonq;1,2-Dixy7no-1,5-diMqthyl-2-phqnyl-3H-pyrczol-3-onq;2,3-DiMqthyl-1-phqnyl-3-pyrczolin-5-onq 60-80-0
EB病毒轉化的人B細胞;MaoPenicillin&Streptomycin&AmphotericinBsolution,γ-Irradiated青霉素鏈霉素兩性霉素B溶液750U高,90%,適合電泳
二:大鼠正常細胞L-胱酸25克RT,避光
CM-H064人腎上皮細胞完全培養基100mLAMPSO 25g/100g/1kg原裝 Amresco J625
羽扇豆源性成分探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒FCGR2B Others Cynomolgus 食蟹猴 CD32b / FCGR2B 人細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) 3-O-β-D-葡萄糖( 1→4)-[ a -L-鼠李糖(1→2)]- a-L-阿拉伯糖 23-羥基羽扇豆20(29)-1-28–酸;白頭翁皂苷DV質(zhì)量規格:HPLC≥98%,標準品
HBMEC 人腦微內皮細胞羅漢果皂苷IvaMogroside IVa 質(zhì)量規格:HPLC≥98%,標準品
中國倉鼠卵巢細胞K1(亞系克隆);CHO-K13A-氨基-3A-脫氧-(2AS,3AS)-β-環(huán)糊精水合物(>97.0%(T))3A-Amino-3A-deoxy-(2AS,3AS)-β-cyclodextrin Hydrate質(zhì)量規格:>97.0%(T)
lovo, 人細胞3A-氨基-3A-脫氧-(2AS,3AS)-α-環(huán)糊精水合物(>90.0%(HPLC))3A-Amino-3A-deoxy-(2AS,3AS)-α-cyclodextrin Hydrate質(zhì)量規格:>90.0%(HPLC)
人癌細胞;MDA-MB-157 大鼠小腸內皮細胞完全培養基 100mL3A-氨基-3A-脫氧-(2AS,3AS)-γ-環(huán)糊精水合物(>95.0%(HPLC))3A-Amino-3A-deoxy-(2AS,3AS)-γ-cyclodextrin Hydrate質(zhì)量規格:>95.0%(HPLC)
實(shí)驗過(guò)程:
一、試劑準備
1. DNA模板
2.對應目的基因的特異引物(在PCR反應中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制,而不能從無(wú)到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物??梢允?/span>DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據你的模板鏈設計。因此,擴增不同的基因需要設計不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結束反應,PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
1.PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設立一個(gè)專(zhuān)用的PCR實(shí)驗室。
2.純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結果,純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
3.所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
4.PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
5.試劑都應該以大體積配制,試驗一下是否滿(mǎn)意,然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?,從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
6.試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi),并且要充分混勻。