產(chǎn)品展廳
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探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：
產(chǎn)品名稱(chēng) | 英文名稱(chēng) | 貨號 |
鷓鴣源性成分探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 | BKP7447 |
概述：
產(chǎn)品僅供科研使用熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴增過(guò)程中，隨著(zhù)PCR循環(huán)數的遞增，PCR產(chǎn)物不斷積累，熒光信號也會(huì )相應的增加，這樣就可以通過(guò)熒光強度的變化來(lái)對PCR反應進(jìn)行實(shí)時(shí)的監測。本公司根據您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針?lè )?。通過(guò)對DNA或RNA的熒光定量PCR監測, 實(shí)現基因的相對定量、定量和定性分析。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對每個(gè)樣品Ct值的計算，根據標準曲線(xiàn)獲得定量結果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內標是建立在兩個(gè)基礎之上的：
1）Ct值的重現性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數擴增期（對數期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時(shí)間擴增或同一時(shí)間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線(xiàn)性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數存在線(xiàn)性關(guān)系，可利用標準曲線(xiàn)對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標準曲線(xiàn)定量的方法。
外標準曲線(xiàn)的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴(lài)的科學(xué)方法。利用外標準曲線(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性*的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
使用方法：
一、鷓鴣源性成分探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒稀釋PCR陽(yáng)性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）
1. 注意：產(chǎn)品僅供科研使用由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩定性和避免擴散病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽(yáng)性對照。
2. 標記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個(gè)樣品，必須設置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?/span>10μL上步制備的PCR陽(yáng)性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬(wàn)拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設置qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
10. 如果只做1次重復，則標記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對照，6個(gè)用于PCR陽(yáng)性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數量相應增加2或3倍。
11. 產(chǎn)品僅用于科研在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽(yáng)性對照，并且陽(yáng)性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）
熒光定量PCR服務(wù)：
簡(jiǎn)介：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗結果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請提供已知的全長(cháng)基因序列。
（03）請提供盡可能詳細的背景資料：DNA/RNA 來(lái)源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗，進(jìn)行實(shí)驗結果分析。
（04）實(shí)驗完成后，提供完整的實(shí)驗報告（含軟件分析結果）及引物等實(shí)驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準：
我公司根據客戶(hù)的樣品數量進(jìn)行不同的收費標準。
實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允?/span>DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1（10pM） 2μl
引物2（10PM） 2μl
Taq酶（2U/μl） 1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設立一個(gè)專(zhuān)用的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
人脈絡(luò )叢內皮細胞cDNAHCPEC cDNA3-(環(huán)己基)-1-磺酸鈉鹽100毫克
CDK7 & CCNH & MNAT1 Others Human 人 CDK7 & CCNH & MNAT1 Heteroimer 桿狀病毒-昆蟲(chóng)細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) 2,3-二酚 2,3-DIMqTHYLPHqNOL PqSTcNcL 26-72-0
615小鼠T細胞性瘤株;L7912-4-磺酰胺100毫克保存：-20℃
Eca-109細胞，細胞 人食管鱗癌,KYSE 150細胞 中國倉鼠卵巢細胞(亞系克隆);CHO-HCV-NS5A全胃蛋白胨25克2～8℃，避光
小鼠誘導性多潛能干細胞;PUMC-mips-C478056-39-02-硝基-4,5-二扶本胺4,5-DIFLUORO-2-nitnOANILINE
NRG1 Protein Human 重組人 NRG1-alpha 蛋白 (ECD, His 標簽)交叉縫式碳納米管 10-20nm(直徑),5-15μm(長(cháng)度)質(zhì)量規格：>95%(TPO Method)Carbon Nanotube Herringbone 10-20nm(diam.), 5-15μm(length)
NCI-H460(人細胞) 5×106cells/瓶×2 腎動(dòng)脈內皮細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)復壁碳納米管 小于10nm(直徑),5-15μm(長(cháng)度)(允許溫度上限:620℃)質(zhì)量規格：Carbon Nanotube Bundled Multi-walled below 10nm(diam.), 5-15μm(length) (allowable temperature limit : 620°C)
支原體PCR檢測試劑盒MYCO復壁碳納米管 小于10nm(直徑),5-15μm(長(cháng)度)質(zhì)量規格：>95%(TPO Method)Carbon Nanotube Multi-walled below 10nm(diam.), 5-15μm(length)
IL12A & IL12B Others Human 人 IL12A & IL12B Heterodimer 人細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) 復壁碳納米管 小于10nm(直徑),1-2μm(長(cháng)度)質(zhì)量規格：>95%(TPO Method)Carbon Nanotube Multi-walled below 10nm(diam.), 1-2μm(length)
CatS2 家貓皮膚成纖維樣細胞雙(亞甲基二硫代)四硫富瓦1[有機電子材料]質(zhì)量規格：Bis(methylenedithio)tetrathiafulvalene [Organic Electronic Material]
小鼠網(wǎng)織細胞;M5076 小鼠腸巨噬細胞完全培養基 100mL雷瑣辛，英文名或英文縮寫(xiě)：Resorinol，級別：IPC，99%，規格：250毫克
rRTEC, 大鼠腎小管上皮細胞 Rattus肖醋鈷;肖醋亞鈷;六水合肖醋鈷 Cobclfous nitnctq;Cobcltous nitnctq hqxchydrctq 1006--9
SMOC1 Others Human 人 SMOC1 人細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) NEXTGEL12.5%SOLUTIONNEXT GEL 12.5%蛋白組學(xué)級透明無(wú)色液體RTsigma
EB病毒轉化的人B細胞;Mao六扶鋁酸，英文名或英文縮寫(xiě)：Ammonium fluoaluminate，級別：CP，41%，規格：5克
PROK1 Others Human 人 EG-VEGF / prokineticin-1 桿狀病毒-昆蟲(chóng)細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) (5’-1酸腺苷二鈉)
鷓鴣源性成分探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒恒河猴腎細胞;RM-26-O-α-D-麥芽糖基-β-環(huán)糊精(>98.0%(HPLC))6-O-α-D-Maltosyl-β-cyclodextrin質(zhì)量規格：>98.0%(HPLC)
LRG1 Others Human 人 LRG1 人細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) *基-β-環(huán)糊精(>98.0%(HPLC))Trimethyl-β-cyclodextrin質(zhì)量規格：>98.0%(HPLC)
胰腺星狀細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)3,5-雙[3,5-雙(芐氧基)芐氧基]芐溴(>97.0%(HPLC))3,5-Bis[3,5-bis(benzyloxy)benzyloxy]benzyl Bromide質(zhì)量規格：>97.0%(HPLC)
JEG-3/VP16-TNFa細胞，人絨癌細胞VP16耐藥株TNFa轉染 人癌細胞,SK-BR-3細胞 成纖維細胞生長(cháng)添加物-2FGS-23,5-雙(3,5-二甲氧基芐氧基)芐醇(>94.0%(GC))3,5-Bis(3,5-dimethoxybenzyloxy)benzyl Alcohol質(zhì)量規格：>94.0%(GC)
水牛皮膚成纖維樣細胞;WB-S13,5-雙(3,5-二甲氧基芐氧基)芐溴(>97.0%(HPLC)(T))3,5-Bis(3,5-dimethoxybenzyloxy)benzyl Bromide質(zhì)量規格：>97.0%(HPLC)(T)
